類器官的培養(yǎng)可以利用體細胞、成體干細胞（包括祖細胞）或多能干細胞。2009年，腸道器官模擬技術取得突破，研究人員發(fā)現，成人腸道干細胞可以在體外增殖和自發(fā)組織化。其特征是能夠表達LGR5，這是一種編碼Wnt激動劑R-spondin受體的基因，同時需要特定的分子圍繞在旁（如Wnt、KGF和noggin）。以此為理論基礎，研究人員開發(fā)了一種三維培養(yǎng)體系，能夠在體外重建腸道干細胞的適宜環(huán)境，并從腸道上皮細胞或單個LGR5+干細胞分化出具有自我更新能力、保持腸道腺窩絨毛狀結構的類器官。該模型可以持續(xù)擴增達3個月，穩(wěn)定的基因組保證了純化和生產放大等優(yōu)勢，此后這種方法被用于從其它主要器官上皮組織培養(yǎng)各種類器官。

成人干細胞衍生的類器官培養(yǎng)，通常是通過將分離的成人干細胞或所需器官培養(yǎng)的單細胞懸浮液，嵌入到細胞外基質（ECM）水凝膠中來建立的。例如腸道器官，從小腸或結腸分離出的隱窩細胞足以培養(yǎng)出類器官，也可以從分離的成人腸干細胞中培養(yǎng)出類器官。

上皮類器官培養(yǎng)基是以附加與器官相關的生長因子的培養(yǎng)基為基礎的。因此，從其他組織（如呼吸道、肝臟、胰腺、皮膚、膀胱、大腦、心臟）提取的細胞器要求在培養(yǎng)中補充相關生長因子。例如大腦類器官培養(yǎng)過程如下圖：誘導多能干細胞（iPSC）衍生細胞在神經誘導介質中生長，產生神經外胚層，嵌入Matrigel中，并在旋轉生物反應器或軌道搖床中生長，以更好地擴散，獲得三維腦器官。在暴露于維甲酸的情況下，大腦器官通過自我組裝模式，形成自締和組織，形成包括放射狀膠質細胞在內的不同種群的神經祖細胞，這些神經祖細胞擴展形成大腦結構。

除了成體干細胞，多能干細胞（包括誘導干細胞和胚胎干細胞）也可以利用其自我更新及分化能力來制備類器官。由于從多能干細胞中提取的類器官是通過 同質群體定向分化而形成的，因此，必須在一個喚醒胚胎發(fā)生的動態(tài)過程中重新創(chuàng)造組織特異性細胞類型及其微環(huán)境。因此，多能干細胞類器官培養(yǎng)必須在分化過程中提供合適的生態(tài)位信號。由于這一過程較復雜，多能干細胞類器官往往含有不同于模型器官的細胞類型，使靶組織的信號環(huán)境和自組織復雜化。